El espermatozoide es la célula final de un largo y complejo proceso de diferenciación celular. El estudio del semen es una manera de evaluar la capacidad reproductiva de un animal y las pruebas de laboratorio son útiles para evaluar la calidad seminal, siendo algunas características de alta correlación con la fertilidad de un macho y otras aún discutidas. Todas estas pruebas de laboratorio deben ir acompañadas de un exhaustiva anamnesis y revisación clínica del individuo en cuestión.

Inmediatamente después de la recolección, cada eyaculado deberá ser sometido a una serie de análisis de rutina, que sean simples y de los mejores disponibles.

No existe una sola característica en el semen que de por sí sea capaz de evaluar la fecundidad del macho. Es por esto que la valoración potencial del poder fecundante incluye diversas pruebas, cada una de ellas de gran valor, pero que solamente todas juntas permiten alcanzar conclusiones más valederas.

Los métodos histológicos y fisicoquímicos entonces, no tienen nada más que un valor relativo, puesto que en la práctica de la inseminación artificial la fecundidad se valora por la tasa de concepción.

Se detallarán a continuación los distintos análisis de rutina que se deben realizar, a campo, para evaluar un eyaculado de las distintas especies animales, pero refiriéndonos en general a los toros.

1. EXAMEN MACROSCÓPICO.

Mediante esta estimación realizada a simple vista se obtienen datos que permiten evaluar, a grandes rasgos, algunos aspectos cuali y cuantitativos del semen.

VOLUMEN: se expresa en mililitros (ml), valiéndose de la graduación inscripta en el tubo de recolección de vidrio. Como es sabido, este parámetro varía en función de:

Especie

Edad

Raza

Estado fisiológico del individuo

Método de recolección

Estado nutricional

Frecuencia de la recolección

Excitación sexual

Época del año

Peso vivo del animal

El volumen promedio de semen presente en un eyaculado varía en las distintas especies animales, siendo en toros de 5 a 7 ml, dentro de un rango que oscila entre 1-2 ml en jóvenes y hasta 20 ml en individuos adultos de gran porte.

El segundo eyaculado obtenido 15 a 20 minutos luego del primero puede llegar a ser más voluminoso, pero esta diferencia podría no existir en el caso de una muy buena excitación antes de la primera recolección. En general, los animales bovinos de razas lecheras dan un eyaculado de mayor volumen que aquellos de biotipo carnicero.

También es sabido que con el uso de la electroeyaculación el volumen y la densidad del eyaculado sufren variaciones, que no han de ser consideradas como alteraciones en la producción de semen por parte del animal.

Las desviaciones en cuanto a volumen con respecto al rango promedio no se correlaciona, en general, con la fertilidad, subfertilidad o esterilidad del macho, a menos de que exista ausencia completa de eyaculado. No obstante, cuando se colectan varios mililitros de un semen concentrado con razonable facilidad se puede inferir que el macho en cuestión es capaz de producir buenos eyaculados.

COLOR Y DENSIDAD: Normalmente el semen de los animales suele ser de un color blanco cremoso, pero esto está en estrecha relación con la cantidad de espermatozoides presentes en el eyaculado, es decir con la concentración espermática. Existe una alta y positiva correlación entre viscosidad y concentración de espermatozoides. Cuando la densidad es normal, el semen tiene aspecto parecido al de la crema de leche.

La coloración amarillenta se debe a la riboflavina segregada por las glándulas vesiculares y ampollas del conducto deferente, no teniendo ningún tipo de significación clínica. Otras veces puede deberse a la presencia de pus (piospermia) u orina, y en ambos casos el poder fecundante de los animales puede estar comprometido; recordemos que la presencia de pus indica inflamación, y que la orina es espermicida.

Una coloración rojiza puede ocurrir por la presencia de sangre en los casos en que existan heridas de pene y prepucio o tracto genital, o bien a causa de heridas y lesiones en el momento mismo de la recolección, produciéndose hemorragias y contaminando el eyaculado. El semen con estas características ha de ser descartado, ya que los eosinófilos presentan una enzima (amilasa) que destruye los factores de capacitación producidos en el epidídimo.

La presencia de Pseudomona aeruginosa en el semen puede provocar una coloración verdosa del mismo, a partir de la presencia de pigmentos propios de esta bacteria. Por otra parte la presencia de heces en el semen se demuestra por una coloración amarronada.

Entre el color, la fluidez y la concentración existe una cierta relación que debe ser tenida en cuenta en el momento de la evaluación macroscópica del eyaculado.

MOTILIDAD DE MASA MACROSCÓPICA: Esta determinación nos da una idea acerca de la concentración espermática. Resultados negativos no son importantes hasta la corroboración microscópica de este hecho. En el eyaculado del carnero se aprecia muy bien al ser un semen de alta concentración.

pH: Muchos autores han minimizado los cambios de pH del semen, ya que infinidad de factores como temperatura de conservación, método de extracción, concentración espermática y muchos más parecen influenciarlo.

Lo cierto es que su determinación es muy sencilla con las tiras reactivas específicas para tal fin, colocando unas gotas de semen en ellas, estando sostenidas por una pinza.

El pH normal del semen bovino es cercano a la neutralidad, de 6,7 a 7; este parámetro no varía mucho en las distintas especies animales. Ante la sospecha de cualquier afección inflamatoria de uno de los órganos genitales, se verificará con éste método un aumento del pH (tendencia a la alcalinidad).

CUERPOS EXTRAÑOS: La presencia de alguno de éstos, como polvo, tierra, pasto, heces, etc. es indicadora de una mala técnica de extracción de semen.

2. EXAMEN MICROSCÓPICO

Es necesario para este tipo de evaluación que todo el material de vidrio se encuentre a 37 grados centígrados (pipetas, portaobjetos, cubreobjetos, diluyentes, colorantes, etc.). Para esto, es conveniente utilizar una platina térmica para la valoración del eyaculado.

El examen microscópico del semen fresco es de una importancia absoluta para juzgar el destino del eyaculado obtenido, es decir su procesamiento para inseminación artificial o su descarte.

Las dos determinaciones microscópicas de semejante importancia para la evaluación del semen son la motilidad espermática (tanto en masa como individual) y la morfología del espermatozoide.

Examen de la motilidad espermática

Los espermatozoides se encuentran en un estado latente dentro de la cola del epidídimo. Para ser móviles, necesitan de un pH normal, temperatura templada, un medio con osmolaridad balanceada y adecuada concentración de iones y nutrientes en el fluido seminal.

Es muy fácil inhibir la motilidad por medio de la contaminación de las muestras de semen o un manejo inadecuado. Por ejemplo, es un descuido relativamente frecuente la contaminación con residuos de jabón al ser lavados los materiales de vidrio, o también la presencia de distintas sustancias químicas que son transportadas por los dedos sobre los portaobjetos.

Por otra parte, es real la importancia de una temperatura correcta del material de vidrio, ya que aumentos o disminuciones aún mínimas reducen la motilidad del esperma. Tan pronto como se deshidrate o enfríe la gota de semen sobre el portaobjeto o sobre la platina del microscopio por la exposición al viento, se producirá un rápido deterioro sobre la motilidad espermática.

La viabilidad de los espermatozoides en el fluido seminal no permanece por demasiado tiempo, y los mismos pierden rápidamente el vigor del movimiento progresivo; por lo tanto las muestras deben ser examinadas inmediatamente luego de la colección.

Eyaculaciones repetidas pueden resultar en una mejor motilidad espermática en aquellos animales que no han eyaculado por largo tiempo.

MOTILIDAD DE MASA: para esta determinación se debe colocar una pequeña gota de semen, de aproximadamente 5 a 10 mm de diámetro, mediante una varilla de vidrio o Pipeta Pasteur sobre un portaobjetos colocado sobre la platina térmica a 37 grados centígrados, o bien precalentado en la llama de un mechero. Posteriormente y sin colocar el cubreobjetos se observa con pequeño aumento (4x a 10x) los bordes de la gota y la zona ubicada entre el centro y el borde de la misma. Para incrementar el contraste puede cerrarse el condensador del diafragma o, en microscopios sin diafragma, el condensador se puede reducir. Para su evaluación se puede utilizar una escala subjetiva del 0 al 5:

0 = no hay espermatozoides

1 = algunos espermatozoides se mueven en su sitio

2 = hay espermatozoides móviles pero no alcanzan a formarse ondas (menos de 50 % de espermatozoides móviles)

3 = hay formación de ondas o remolinos muy lentos (50 a 70 % de espermatozoides móviles)

4 = las ondas o remolinos se forman rápidamente (70 a 90 % de espermatozoides móviles)

5 = la velocidad de formación de las ondas es extremadamente alta (más del 90 % de espermatozoides móviles)

Aquellos eyaculados clasificados como 0, 1 y 2 deberán ser descartados.

Existe a su vez otra descripción también empleada por otros autores para evaluar la motilidad masal, y esta es:

Muy buena: movimiento en ondas vigoroso y en remolinos

Buena: remolinos y ondas más lentas

Regular: sin remolinos, pero con oscilaciones generalizadas

Malo: escasa o ninguna motilidad individual

El movimiento en masa depende de tres factores: concentración, porcentaje de células con movimiento progresivo y velocidad de movimiento de los espermatozoides. Cuando uno de estos parámetros se encuentra disminuido, las ondas rápidas en remolinos esperadas son severamente deprimidas o eliminadas. Por ejemplo, un semen con una consistencia acuosa puede tener un 80 % de motilidad progresiva individual, pero no habrá ondas de movimiento; mientras que un semen altamente concentrado con sólo 50% de motilidad espermática mostrará algunas ondas de movimiento.

Por otro lado, un eyaculado con muy buena concentración y un alto porcentaje de movimiento progresivo individual puede producir poco o nada de movimiento de onda si la velocidad de los espermatozoides ha sido disminuida por temperaturas frías o por haber transcurrido un largo intervalo de tiempo entre la colección y la evaluación.

Por todo lo expuesto anteriormente, la motilidad masal debe ser interpretada cuidadosamente. Generalmente se espera el movimiento de onda cuando la muestra de semen posee una buena concentración. Si el movimiento de onda está presente, no es necesario analizar la motilidad posteriormente. En cambio, si está ausente, se deberá hacer el examen de motilidad progresiva individual. Cuando las muestras estén diluidas sólo se podrá evaluar la motilidad individual.

Por último, cabe aclarar que existe otra técnica para evaluar la motilidad de masa, llamada la técnica de la gota pendiente, utilizando para ello un portaobjeto excavado. Se coloca la gota de semen, la cual no debe ser demasiado grande y debe quedar en forma esférica, sobre un cubreobjetos, y luego se superponen cubre y porta. La visión de esta manera es particularmente clara y los espermatozoides adquieren el máximo dinamismo.

MOTILIDAD INDIVIDUAL: debe evaluarse con el semen diluido. La técnica consiste en los siguientes pasos:

1.Colocar 2 gotas de diluyente (citrato sódico al 2,92%, PG5, Diliplus, etc.) entibiado a 35 – 37 grados centígrados en un extremo del portaobjeto.

2.Agregar una gota de semen de 3 a 4 ml al diluyente.

3.Homogeneizar con varilla de vidrio o pipeta, con extrema suavidad.

4.De esta dilución, se levanta una gotita con el ángulo de un cubreobjetos, con pipeta o pajuela y se coloca en el otro extremo del porta, cubriéndola con un cubre.

5.Eventualmente, se puede cubrir con un cubre la primera gotita diluida en el paso 1, pero sólo si ésta es lo suficientemente pequeña.

6.Se coloca en el microscopio y se observa en un aumento de 200 a 500 veces, preferentemente bajo contraste de fases.

Otros autores indican que se debe preparar la primera muestra con el semen sin diluir, incluso cuando la cantidad de espermatozoides presentes haga difícil determinar la cantidad de células con movimiento progresivo. Soluciones salinas o diluyentes salinos buferados que no hayan sido preparados recientemente podrían cambiar el pH, y esto induciría a una disminución de la motilidad, llevando a resultados erróneos. Con preparaciones bien hechas no serían necesarias diluciones de semen.

Los movimientos de los espermatozoides que deben ser tenidos en cuenta son los siguientes:

Progresivo rectilíneo: es un movimiento activo y enérgico que consiste en un desplazamiento hacia delante. Se presume que cuanto mayor sea el número de espermatozoides con este movimiento, mayor será el poder fecundante del eyaculado. La velocidad del espermatozoide en las distintas especies animales se estima en 4 a 6 mm/minuto.

Ondulatorio: este movimiento se efectúa lentamente y con un pequeño desplazamiento, originado por golpes lentos y laterales de la cola en toda su extensión.

Rotatorio: son movimientos sobre sí mismo con un radio reducido y a relativa velocidad.

Inmovilidad absoluta.

Mediante métodos de observación fotoeléctrica al paso de los espermatozoides, se ha determinado que existen propiedades que caracterizan al movimiento espermático normal, y estos son:

-La órbita de movimiento es una curva ligera.

-La célula posee un movimiento de rotación sobre su eje longitudinal.

-La ondulación de la cola es de tipo tridimensional.

Para la valoración de la motilidad individual pueden utilizarse distintos métodos prácticos; uno de ellos es el siguiente:

Muy buena: 80 – 100 % de células móviles

Buena: 60 – 79 % de células móviles

Regular: 40 – 59 % de células móviles

Mala: Menos de 40 % de células móviles

La valoración de la motilidad individual y los porcentajes de los diversos tipos de movimientos en ambos métodos es sumamente subjetiva. Para determinarla se cuentan 10 espermatozoides por campo microscópico y se anota el tipo de movimiento.

Ejemplo:

7 espermatozoides con movimiento progresivo rectilíneo

2 espermatozoides con movimiento rotativo

1 espermatozoide sin movimiento

Se deben contar varios campos microscópicos y hacer un promedio. Debe recordarse que las muestras de semen manejadas incorrectamente, enfriadas o excesivamente calentadas no reflejan con exactitud la vitalidad de los espermatozoides.

Es necesario tener en cuenta que la motilidad individual y la estimación del porcentaje de células con movimiento progresivo nos dan información acerca de la integridad de la membrana del espermatozoide, como así también de su integridad morfológica. Por ejemplo, si un alto porcentaje de células tiene motilidad progresiva normal pero luego encontramos que existe en la muestra un alto número de piezas medias dobladas o espermatozoides muertos, nos indica un defecto en el manejo del semen más que un eyaculado anormal. Si la inconsistencia en las observaciones entre la motilidad y la morfología crece, la causa deberá ser establecida. Puede llegar a hacerse necesario repetir todo el procedimiento desde la extracción del semen.

Examen de la morfología espermática

El estudio de la morfología espermática es muy importante en la valoración de la fertilidad de los animales, a los fines de establecer porcentajes de espermatozoides normales y poder clasificar las anormalidades. Tiene un valor definido en el estudio de las patologías testiculares (degeneración testicular, orquitis, hipoplasia, etc.) y en el estudio de los defectos hereditarios de los espermatozoides. Existe una alta correlación entre los defectos espermáticos e infertilidad. Básicamente, se considera tolerable hasta un 30 % de anormalidades, con una gran gama de formas anormales y criterios de clasificación que serán revisados posteriormente.

Preparación del extendido de semen: los espermatozoides son traslúcidos y virtualmente invisibles al microscopio de luz directa. Por lo tanto, se requiere del uso de colorantes o la provisión de un fondo oscuro para visualizarlos. La técnica de tinción en un solo paso, en donde se mezcla el colorante con los espermatozoides directamente en el portaobjeto es la más recomendable, porque todo lo que se encuentra en el semen puede ser observado. Por ejemplo, con la tinción Rosa de Bengala, todos los espermatozoides se ven rosas sobre un fondo limpio, mientras que con la Tinta China el fondo es oscuro, los espermatozoides permanecen sin teñirse y aparecen blancos. Las tinciones que requieren varios pasos, incluyendo lavados, son más perjudiciales para los espermatozoides y probablemente más inexactas dado que pueden lavar algunos elementos del semen y cambiar el resultado final.

Son múltiples los métodos de coloraciones para observar la morfología de los espermatozoides y la relación vivos:muertos. A continuación se describirán los métodos más comunes:

a) Coloración Vital con eosina-nigrosina: este método es el más comúnmente utilizado para determinar la relación vivos:muertos en un eyaculado. Cuando el semen se ha manejado correctamente y la tinción es llevada a cabo en forma apropiada, el porcentaje de espermatozoides vivos está altamente correlacionado con la motilidad progresiva individual. Por lo tanto, esta técnica es útil para corroborar las estimaciones hechas en las técnicas anteriores de motilidad. Vale la pena recordar que todos los elementos deben estar a 35-37 grados centígrados. La técnica es la siguiente:

Colocar una gota de semen en un portaobjetos

Colocar dos gotas de Eosina al 5% en agua destilada y revolver la mezcla con el ángulo de un porta o con un palillo durante no más de 30 segundos.

Colocar una gota del doble volumen que el anterior (por lo tanto, el cuádruple volumen del semen) de una solución de Nigrosina al 10 % en agua destilada.

Se toma una gota de la mezcla y se realiza el frotis

Secar al aire y observar con objetivo de inmersión de aceite a 1000-1250 aumentos

Para la valoración de vivos y muertos se deben contar 200 espermatozoides en promedio (100 a 300, dependiendo si encontramos pocas o muchas anormalidades respectivamente), recorriendo el preparado en forma de guarda griega. Los contadores manuales facilitan mucho la técnica pero son aún muy costosos.

Interpretación: Los espermatozoides sin teñir (blancos) se consideran vivos y los teñidos (rosa) total o parcialmente se consideran muertos. Esto es así porque la Eosina penetra la membrana de las células dañadas tiñiendo las lesiones y por ende a los espermatozoides no viables; en cambio, células en perfecto estado repelen a la eosina, por lo que aparecen sin teñir.

Es importante no esperar más de 30 segundos en la acción del colorante, porque se corre el riesgo de que los espermatozoides vivos comiencen a colorearse. La nigrosina actúa como colorante de contraste, ya que brinda un fondo oscuro.

Se recomienda no conservar mezcladas las soluciones de eosina y nigrosina, excepto en el momento de su empleo. Estos colorantes, por separado, se mantienen estables durante un año o más sin refrigeración.

Otra variante en esta técnica es el uso de Eosina con Azul de Anilina.

Vale la pena aclarar que existen en el mercado Colorantes Vitales ya preparados que simplifican mucho la técnica.

b) Coloración con Rosa de Bengala al 3%: la técnica es la siguiente:

Colocar una gota de semen en el portaobjetos

Realizar un frotis

Secar al aire

Fijar el frotis pasándolo 3 o 4 veces por la llama de un mechero o con alcohol metílico durante un minuto.

Cubrir el porta con solución de Rosa de Bengala al 3% durante 5 minutos.

Lavar con agua destilada

Escurrir y dejar secar al aire o con estufa a 37 grados centígrados

Observar con objetivo de inmersión y aceite de cedro

El frotis debe ser delgado y realizado suavemente con el borde de un cubreobjetos que se inclinará a 45 grados centígrados. Si el semen es demasiado concentrado es recomendable realizar una dilución previa a realizar el frotis.

Para la preparación de la solución de colorante los reactivos a emplear son los siguientes:

1)Rosa de Bengala: 0.3 mg

2)Formol al 40 %: 0.1 ml

3)Agua Destilada: 9.9 ml

Se deben contar por lo menos 200 espermatozoides y anotarse las anormalidades espermáticas.

c) Coloración con Tinta China: es un método de coloración muy sencillo, práctico y rápido. Se realiza con tinta china comercial de alta concentración, siguiendo los pasos a continuación:

Colocar una gota de semen en un portaobjetos

Colocar 5 gotas de tinta china y mezclar con varilla de vidrio

Hacer el frotis y secar al aire

Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro

Este método consiste en una coloración negativa, es decir, en ella aparecen los espermatozoides sin teñir o en tono claro sobre un fondo gris negruzco, poniéndose de manifiesto la forma de la cabeza y la existencia de la gota protoplasmática.

ANORMALIDADES ESPERMÁTICAS

Las anormalidades espermáticas que pueden observarse en los animales se presentan simultánea o separadamente en la cabeza, cuello, pieza intermedia y parte principal de la cola. En general, muchas de las alteraciones de este tipo son menos frecuentes de lo que se piensa, pudiendo presentarse algunas por errores de la técnica de coloración o manipulación de la muestra de semen, que pueden prestar a la confusión.

Es de crucial importancia familiarizarse primero con la morfología de los espermatozoides normales, para asegurarse una correcta detección de las anormalidades. En los animales bovinos, las cabezas pueden presentar formas más alargadas y delgadas, considerándose esto como no patológico. Asimismo, algunas cabezas pueden presentarse más cortas y anchas, y aún así ser normales en esta especie.

A continuación se hará una revisión de las alteraciones más frecuentes en el semen del bovino.

1. Cabezas piriformes y angostas: presentan la zona posacrosomal más estrecha. Los espermatozoides con formas piriformes evidentes son anormales. En la mayoría de los casos se encuentran estas anomalías junto con otras e indican defectos en la espermatogénesis. No obstante, se conocen casos en los que la mayoría de los espermatozoides eran de este tipo y aún así la fertilidad de los animales fue normal.

2. Microcefalia y macrocefalia: existe una gran variación de tamaño entre espermatozoides con macro y microcefalia. Aunque las cabezas demasiado grandes son comunes, generalmente se encuentran en una proporción muy pequeña en el eyaculado. Aparentemente estos defectos estarían ocasionados por una distribución desigual de los cromosomas durante la meiosis y generalmente la mayoría de las células mueren o son fagocitadas por las células de Sertoli antes de llegar al estadio de espermátide. Esta es la razón por la que no se encuentran en altos porcentajes en los frotis de semen, con excepción del síndrome conocido con “Cabeza plegada-Cresta nuclear-Cabeza gigante”.

3. Vacuolas nucleares: se encuentran primariamente como una línea en la región ecuatorial de la cabeza del espermatozoides (defecto “diadema”), o bien como una o dos vacuolas en el ápex del núcleo. Estas vacuolas se asemejan a cráteres. Con una tinción conocida con el nombre de Feulgen brillan como diamantes (de aquí el nombre de diadema). Aparentemente los espermatozoides con este defecto pueden ser transportados normalmente hacia el oviducto, son capaces de penetrar la zona pelúcida y producir el bloqueo de la polispermia. Sin embargo, esta alteración es incompatible con el desarrollo embrionario.

La importancia de las vacuolas en la región apical está todavía en estudio. Se han encontrado animales que producen altos porcentajes de vacuolas grandes y confluentes. Aunque la incidencia de este defecto es muy baja, tiene alta correlación con porcentajes bajos de fertilidad.

4. Condensación anormal del DNA: este tipo de alteración es únicamente detectada con la Tinción de Feulgen. La cromatina aparece como granular y no homogénea como en los espermatozoides normales. Las células afectadas pueden verse también extendidas y pálidas. Este defecto puede estar relacionado con otros en respuesta a problemas en la espermatogénesis. No obstante, en la mayoría de los casos los porcentajes de espermatozoides con esta alteración son bajos. Se han encontrado casos raros de animales con defectos en la condensación de DNA sin otro signo que indique un disturbio en la espermatogénesis. En estos casos la fertilidad se ve severamente afectada.

5. Formas Teratoides: estas formas anormales producidas por disturbios en la espermatogénesis no deben ser confundidas con células inflamatorias o detritus celulares. Los espermatozoides con estos defectos tienen generalmente una condensación de DNA anormal, un núcleo pequeño y deforme y en la mayoría de los casos la pieza principal está arrollada alrededor del núcleo. Las formas teratoides son generalmente encontradas con una incidencia de hasta 2% en el semen normal. En muestras de animales con disturbios graves en la espermatogénesis su incidencia aumenta entre un 5 a 10 %.

Se encontró una alta incidencia de este defecto en dos animales de la raza Charolais emparentados y un Aberdeen Angus. Estos animales tenían testículos bien desarrollados y firmes, y presentaban un eyaculado de apariencia macroscópica normal. Sin embargo, en el análisis microscópico se encontró una gran cantidad de formas teratoides y muy pocas células se parecían en realidad a los espermatozoides. Ninguno de estos animales recuperó su fertilidad con el tiempo, y fueron observados durante un período de dos años.

6. Defectos en el acrosoma: en este tipo de alteraciones nos encontramos con un acrosoma aumentado de tamaño (generalmente conteniendo un quiste y un cuerpo de inclusión) que se pliega en la región apical de la cabeza del espermatozoide. Con la tinción de Eosina-Nigrosina se observa que la mayoría de los espermatozoides tiene la región apical chata o una pequeña invaginación. Si realizamos tinciones especiales se puede ver el cuerpo de inclusión dentro del pliegue del ápex.

Este defecto ha sido observado en animales Frisios y fue vinculado a un gen recesivo, por lo tanto es aparentemente heredable en esta raza y tal vez en otras. Es bastante común en toros Charolais. Se ha demostrado que los espermatozoides afectados no pueden atravesar la zona pelúcida.

7. Cabezas sueltas: se pueden hallar espermatozoides decapitados en un pequeño número en el semen normal. Ese defecto puede ser producido por un envejecimiento o por una alteración en la implantación de la cola en la placa basal. Cuando se encuentran en mayor cantidad, están asociados con defectos en la termorregulación del testículo (animales gordos) y en estos casos es producido, aparentemente, por un defecto en la espermiogénesis. En los casos de individuos demasiado gordos esta alteración se encuentra asociada con otros defectos espermáticos, Ej. Cabezas piriformes sueltas.

Las cabezas sueltas y muchos espermatozoides muertos se encuentran en animales con una acumulación de semen en la cola del epidídimo (fenómeno conocido como rusty load). Normalmente los espermatozoides envejecidos son eliminados de la cola del epidídimo a través de un movimiento peristáltico hacia la uretra. Los animales con alteraciones en este mecanismo tienen una gran acumulación de espermatozoides muertos y viejos en la cola del epidídimo.

8. Espermatozoides decapitados: se ha descripto este fenómeno como hereditario en doce toros Guersney y dos Hereford en Dinamarca e Inglaterra; en ambos casos la mayoría de los espermatozoides se encontraban decapitados. También se ha descripto esta alteración en animales de las razas Simmental y Chianina.

9. Síndrome de Cabeza Plegada-Cresta Nuclear-Cabeza Gigante: defecto de origen genético, raro, reportado originalmente en Europa y diagnosticado en algunos animales Holstein y Jersey, hijos de toros cuyo semen fue importado desde Europa. Las cabezas gigantes pueden ser diploides o poliploides, y pueden poseer una cresta central o estar plegadas con un alto porcentaje de colas dobles. Además de estos espermatozoides defectuosos, se pueden observar también una gran variedad de otras alteraciones en el mismo eyaculado de los animales afectados por este síndrome.

10. Pieza Media distal plegada: Suele combinarse con pieza principal doblada. Estos defectos se producen en la cola del epidídimo o en los últimos pasos de la espematogénesis. No obstante, son generalmente encontrados junto con otros defectos originados en el epidídimo. Son frecuentes de hallar en toros estresados.

La mayoría de los animales se recuperan rápidamente quitadas las causas que los llevaron al estrés. Sin embargo, hay algunos toros que evidencian este defecto de acuerdo a la estación del año; por ejemplo, en Canadá se encontraron individuos que mostraban esta alteración en el invierno, y la situación se normalizaba cuando llegaba el verano.

En la raza Jersey se han visto animales con más de un 90 % de espermatozoides con este defecto y se piensa que esta condición permanente es heredable en estos animales.

11. Aplasia segmentaria de la pieza Intermedia y defectos en la vaina mitocondrial: estos pequeños defectos en las mitocondrias no afectan notablemente la motilidad espermática, pero representan una zona frágil que puede terminar en la fractura de la pieza media. Se pueden llegar a encontrar algunos espermatozoides con este defecto en animales con fertilidad normal. Rara vez se hallan en alta incidencia. Un defecto aún menos común es la falta de la porción de la vaina mitocondrial a nivel del anillo.

12. Colas abaxiales, accesorias y múltiples: estas anormalidades están usualmente asociadas entre sí. Sin embargo, las colas abaxiales son las más comunes. La fosa de implantación vacía está casi siempre presente. Se han visto animales que producen hasta un 100% de colas abaxiales sin presentar reducción de la fertilidad. En el defecto de colas accesorias se nota un pequeño muñón, y esta anomalía es poco común pero aparentemente hereditaria. Las colas accesorias están generalmente presentes junto con las abaxiales y las dobles. No se sabe si estos espermatozoides tienen reducida su capacidad de fertilizar el óvulo. La cola es un cilio especializado que se desarrolla del centríolo proximal y distal. De hecho, este defecto se produce cuando se forman más de un cilio a partir de una replicación de los centríolos.

13. Defecto “Dag”: es una interferencia diferencial donde se observa la separación de la cubierta y de las fibras de axonema en la región de la pieza media. La pérdida de la cubierta que recubre a estas fibras resulta en la fractura, explosión, corte y torsión de la pieza media, típicos del defecto Dag. Esta alteración puede ser hallada en algunos espermatozoides debido a disturbios en la espermatogénesis. No obstante, es heredable debido a un gen recesivo en animales de la raza Jersey y posiblemente en la Hereford. Cuando los toros presentan los dos genes recesivos para esta condición producen un 60-100% de los espermatozoides con este defecto.

14. Espermatozoides de cola corta o “Stump tail deffect”: esta alteración no es común, pero ha sido reportada en varias especies de animales domésticos. Es aparentemente heredable y asociado con un gen recesivo. Se presenta en un 50 % de los espermatozoides que poseen una cola rudimentaria y asociada a una gota proximal. Los otros espermatozoides de esa misma muestra suelen tener también la pieza intermedia afectada.

15. Pieza Principal doblada: en este defecto se observa que la pieza principal se encuentra doblada describiendo un rulo o espiral (loop) inmediatamente hacia distal del anillo. Se presenta generalmente asociada con la presencia de espermatozoides con las piezas medias dobladas. En la mayoría de los casos, se observa también una gota citoplasmática distal en el centro del rulo. Este defecto aparentemente se origina en el epidídimo y no hay que confundirlo con el efecto producido por el shock hipotónico o estés por frío de los espermatozoides.

16. Piezas intermedias arqueadas: tienen forma de arco iris o de “U”. Este defecto es generalmente producido por la tinción, aunque pueden hallarse algunos raros casos en donde los animales presentan esta alteración. Cuando se evalúa la motilidad individual se aprecia una gran cantidad de espermatozoides con movimientos en círculos. Para sacarse la duda, siempre se deben comparar las observaciones en la motilidad individual con lo observado en el frotis teñido.

17. Shock hipotónico: este fenómeno ocurre cuando se exponen los espermatozoides por demasiado tiempo al efecto de la tinción con Eosina-Nigrosina, aunque se produce también cuando los cubreobjetos están fríos, o cuando la muestra se contamina con orina. La patología se manifiesta con una curva pronunciada en la pieza principal y, en algunos casos más severos, puede llegar a afectar la pieza media. La diferencia con el defecto de pieza principal doblada es que en el shock hipotónico no se observa una gota citoplasmática en el medio.

Si tenemos una alta incidencia de esta alteración y no estamos seguros de su causa, sería aconsejable realizar un segundo extendido.

18. Gota citoplasmática proximal: casi todos los espermatozoides que se encuentran en la cabeza del epidídimo tienen una gota citoplasmática en esta posición. Luego, a medida que van descendiendo hacia la cola del mismo, la gota se va desplazando hacia distal, al menos en el 90 % de los casos. Una alta incidencia de gotas proximales puede verse con relativa frecuencia en animales jóvenes, quienes aún no han atravesado en forma completa el período de la pubertad. En ejemplares adultos, las gotas proximales en el eyaculado son indicio de disturbios en la función epididimaria o testicular.

Se pueden observar aumentos agudos en el número de gotas proximales 7 a 10 días luego de una situación estresante en animales adultos, lo que indica que han sido afectados los espermatozoides que transitaban por el epidídimo. No obstante, problemas de mayor gravedad en la espermatogénesis pueden también ser causa de esta patología. Por otro lado, algunas anomalías primarias como cabezas piriformes están aparentemente predispuestas a retener la gota proximal. Las gotas suelen ser grandes y redondas en la zona más proximal o haber migrado parcialmente hacia distal, aunque esto último es muy raro. A pesar de que los espermatozoides con estas alteraciones son considerados anormales, no se ha comprobado aún si la gota proximal por sí misma afecta la capacidad de fertilización del espermatozoide.

19. Gota citoplasmática distal: entre el 65 y el 95 % de los espermatozoides almacenados en la cola del epidídimo tienen la gota citoplasmática en esta posición. Este citoplasma residual es liberado cuando los espermatozoides se mezclan con los fluidos seminales en la eyaculación. Existe un factor hemolítico en las vesículas seminales que induce la liberación de esta gota distal. Aparentemente este defecto no afecta la fertilidad, y por lo tanto, si el resto de los espermatozoides es normale el eyaculado en sí se considera no patológico.

20. Células medusas: con este nombre se designan a las células epiteliales ciliadas provenientes del conducto deferente, y se pueden encontrar en bajas cantidades en muestras de semen de animales con defectos graves en la función testicular. Generalmente la muestra de semen está diluída por lo que puede ser necesario centrifugarla para concentrar los espermatozoides. En algunos casos raros puede llegar a verse hasta un 5-10 % de células medusas. La presencia de éstas denota daño testicular grave.

21. Leucocitos: se asocian con procesos inflamatorios en la ampolla, glándulas accesorias o epidídimo. También puede deberse a infecciones de pene o prepucio. Los leucocitos que poseen la membrana celular intacta no se colorean con la eosina, por lo que se los ve como formaciones blancas algo irregulares, y de un diámetro mayor a la cabeza de los espermatozoides. Aquellos con su membrana rota aparecen como cuerpos rosados en desintegración. En caso de sospecharse la presencia de estas células es conveniente realizar tinciones como Wright-Giemsa u otras específicas para tal fin.

ORIGEN DE LAS ANORMALIDADES ESPERMÁTICAS

Clásicamente se ha clasificado a las anormalidades en la morfología de los espermatozoides como primarias y secundarias. Los defectos primarios consideran a aquellos que se originan dentro del testículo durante la espermatogénesis, y los secundarios son los que ocurren dentro del epidídimo. Esta definición hace referencia al origen, y de ninguna manera a la severidad. Es un error creer que los defectos primarios son más graves que los secundarios, ya que pueden alterarse ambos sistemas simultáneamente. Otros autores incluyen dentro de las alteraciones secundarias a aquellas que se producen durante la eyaculación o en las manipulaciones posteriores de la muestra.

Todos los defectos de la cabeza del espermatozoide como alteraciones en el acrosoma, cabezas piriformes, micro y macrocefálicos podrían ser, según la clásica nomenclatura, defectos primarios. La mayoría de las alteraciones en la cola (incluyendo el defecto “Dag”), en la vaina mitocondrial y en la pieza principal también tienen su origen en la espermatogénesis. Sin embargo, algunos autores incluyen a estos tres últimos defectos dentro del grupo de los secundarios porque sugieren que podrían producirse en el tránsito por el epidídimo.

La gota proximal puede resultar tanto de un disturbio en la espermatogénesis, como de una alteración en la función epididimaria. Por su parte las cabezas sueltas también se consideran defecto primario y secundario a la vez, ya que podría darse como resultado de una alteración en la base que conecta la cabeza del espermatozoide con la porción media del capitallum, o bien por una función alterada del epidídimo.

Otros defectos, sin embargo, se consideran netamente secundarios, como las alteraciones en la parte distal del flagelo.

Los espermatozoides con gotas citoplasmáticas distales nunca han sido reportados como asociados a infertilidad ni subfertilidad, por lo que probablemente no deberían considerarse como defectuosos. Aparentemente esta alteración no tiene su origen ni en los túbulos seminíferos ni en el epidídimo, pero cuando se encuentran en gran cantidad se asocian con una carencia del factor hemolítico en el plasma seminal.

Existe un método de clasificación distinto para las anormalidades espermáticas, las cuales se separan en “mayores” y “menores”. En este sistema, los defectos mayores son aquellos que se encuentran asociados a infertilidad, y los menores no. Sin embargo, ahora se sabe que algunas alteraciones consideradas como menores son obviamente defectos estructurales y la fertilización o el desarrollo embrionario serían imposible. Algunos ejemplos de esto son micro y macrocéfalos y pieza media distal doblada. Este último era considerado menor, hasta que se descubrió que era hereditario en animales de la raza Jersey afectando hasta al 100 % de los espermatozoides.

En este momento se considera mucho más apropiado no utilizar ningún sistema de clasificación y considerar en cambio el significado de cada una de las anormalidades espermáticas en la fertilidad.

Espermatozoides anormales que no son transportados al oviducto, y aquellos que sí son transportados pero no son capaces de penetrar la zona pelúcida, pueden ser compensados por un incremento en la dosis espermática (“defectos compensables”). Aquellos anormales que no son filtrados y que son capaces de penetrar la zona pelúcida y causar reacción de zona, no pueden ser compensados por un incremento de la dosis de espermatozoides (“defectos no compensables”).

Se ha demostrado que los espermatozoides con vacuolas nucleares (defecto “diadema”), son transportados normalmente dentro del oviducto. Este es un hallazgo muy importante debido a que la penetración de la zona resultará en una reacción cortical provocando así que la zona pelúcida sea impermeable a otros espermatozoides. Incrementando el número de éstos, no aumentaremos las chances de una fertilidad normal.

NIVELES DE TOLERANCIA DE ESPERMATOZOIDES ANORMALES

Muchos experimentos han demostrado la correlación entre los defectos espermáticos y la infertilidad de los animales. Sin embargo, dada la gran variedad de factores que afectan de un rodeo tanto en servicio natural como en inseminación artificial, pocos experimentos han sido lo suficientemente sensibles para establecer los niveles de tolerancia de varios defectos espermáticos que serían compatibles con una buena fertilidad. Los niveles de tolerancia que son ampliamente aceptados hoy en día fueron establecidos por trabajos hechos hace algunos años y confirmados por otros recientes. Generalmente, el límite máximo de defectos del núcleo (cabeza) del espermatozoide se encuentra en el rango de 15-25%; mientras que defectos del acrosoma y la cola se pueden tolerar hasta un 25%. Como mínimo, un 70 % de los espermatozoides deben ser normales.

La interpretación de un espermiograma anormal, junto con la historia del individuo y un examen físico pueden sugerir la causa de la función testicular anormal, el posible tratamiento y un pronóstico de recuperación de la producción de espermatozoides normales.

En síntesis, en la evaluación de la calidad seminal se pueden tener en cuenta los siguientes criterios y parámetros de clasificación:

DENSIDAD DEL SEMEN

Muy buena: apariencia granulosa, con 750 a 1000 millones de espermatozoides por ml.

Buena: opaco, lechoso, con 400-750 mill espermatozoides/ml.

Regular: apariencia de leche descremada, con 250-400 mill espermatozoides/ml.

Mala: traslúcido o acuoso, con menos de 250 mill espermatozoides/ml.

MOTILIDAD MASAL

Muy Buena: movimiento en ondas, vigoroso

Buena: movimiento en ondas pero más lento

Regular: oscilación generalizada

Mala: movimientos esporádicos

MOTILIDAD INDIVIDUAL

Muy Buena: 80 a 100%

Buena: 60 a 79%

Regular: 40 a 59%

Mala: menor al 40%

MORFOLOGÍA

En general para decir que la morfología es satisfactoria debería haber por lo menos un 70% de espermatozoides normales. No deberían verse más de un 20% con anormalidades nucleares ni más de un 25% con defectos del acrosoma o cola.

RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES

Para realizar de forma fácil y rápida el recuento de espermatozoides se utilizará el método con el hemocitómetro (cámara cuenta glóbulos o cámara de Neubauer) o con cámara de Thoma.

El material necesario es el siguiente:

Cámara cuenta glóbulos con cubreobjetos

Pipeta de 0.1 ml o micropipeta automática

Agua corriente

Tubo de ensayo para hacer la dilución

Pipeta de 5 ml

Pipeta de 1 ml

La técnica para realizar el recuento de espermatozoides se describe a continuación:

a.Colocar en el tubo de ensayo 7.990 ml de agua con las pipetas de 1 y 5 ml.

b.Aspirar el semen con la pipeta de 0.1 ml y descargar 0.01 ml (10 microlitros) en el agua. Con esto el semen se diluye a 1/800. Si se cuenta con un eyaculado poco concentrado se puede hacer una dilución de 1/400.

c.Mezclar bien el contenido del tubo.

d.Llenar ambas hemicámaras colocando el extremo de la pipeta en el borde del cubreobjetos y dejar que la cámara se cargue por capilaridad. El líquido no debe pasar a los surcos laterales ni deben quedar burbujas de aire o zonas sin líquido.

e.Dejar reposar 5 minutos para que los espermatozoides decanten.

f.Contar los 5 cuadrados en la diagonal que va desde la parte superior izquierda a la inferior derecha de la superficie cuadriculada del hemocitómetro. Si se desea, se pueden contar los 25 cuadrados (cada uno dividido a su vez en 16 cuadrados más pequeños), pero los 5 cuadrados mencionados anteriormente dan una cifra suficientemente exacta. Algunos autores recomiendan contar los cuatro cuadrados de las esquinas y uno central. Para evitar errores de omisión o duplicación en el conteo, deben contarse tan sólo los espermatozoides enteros situados en los cuadrados y los situados sobre las líneas limitantes izquierdas e inferiores.

g.Enfocar el reticulado con un aumento de 100x.

h.Contar ambas hemicámaras y hacer el promedio de espermatozoides.